Carlo Ferrari  意大利帕尔马大学

　　免疫应答的动力学：HBV感染早期是关键

　　既往针对HBV感染动物模型（黑猩猩、土拨鼠等）的研究数据表明，机体干扰素（IFN）的诱导基因表达不足，导致了对HBV感染先天性免疫应答的效应缺陷，所诱导的早期细胞内免疫应答非常微弱，表现为一种隐性病毒感染，不易被先天性免疫系统所察觉。纵向研究表明，急性HBV感染所引起的相关细胞因子和趋化因子的应答与急性HIV感染相比明显偏弱、延迟，其结果与动物模型研究的观察结果一致。

　　临床研究表明，HBV感染早期，患者在呈现临床表现之前所产生的I型IFN、IL-15和IFN-λ1水平普遍较低，血清IL-10水平则较高。相反，HBV在此时期可以大量复制，HBV DNA水平在数周内达到峰值，使几乎所有肝细胞受到感染。

　　目前认为，HBV可以主动抑制感染机体的先天性免疫应答，其机理可能是通过非结构性蛋白抑制维甲酸诱导Ⅰ型基因（RIG-1）的表达，影响I型IFN的产生并且阻滞其抗病毒活性。此外，HBsAg、HBeAg等HBV分泌性蛋白可抑制Toll样受体（TLR）表达，中止TLR引起的应答，进一步加重对先天性免疫应答的抑制。

　　为获得早期非溶细胞性HBV清除，机体必须产生及时有效的诱导适应性免疫应答，使HBV DNA水平快速降低，HBV特异性T细胞，特别是CD8+ T细胞，可释放抗病毒活性的细胞因子，延迟激活的NK细胞也可产生IFN-产等大量细胞因子。在强烈、多重且特异的记忆性T细胞应答发挥持久的保护作用下，HBV感染则呈自限性。反之，则发展为慢性HBV感染。

　　慢性HBV感染：T细胞和NK细胞应答及其机制

　　慢性HBV感染患者的HBV特异性CD8+T细胞在肝内聚集，然而其T细胞功能受损耗竭，其CD4+和CD8+T细胞应答发生缺陷，产生IFN-γ、IL-2和TNF-α等细胞因子的能力以及增殖和细胞毒性能力均减退。在高水平的病毒血症时，HBV特异性T细胞耗竭更为严重。

　　NK细胞约占肝内淋巴细胞的30%~40%，可产生IFN-γ和TNF-α等具有抗病毒活性的细胞因子，有助于早期非溶细胞性病毒感染。慢性HBV感染时，肝内NK细胞产生IFN-γ的能力明显受损，而阳性表达CD107α的NK细胞比例无显著变化，表明NK细胞的细胞毒性功能保持正常。NK细胞的这种功能二分法不利于HBV感染的控制，反而持续参与了慢性肝脏炎症和细胞损伤。

　　慢性HBV感染时T细胞功能发生障碍的机制，主要是由于其长时间暴露于大量病毒抗原所致。研究显示，根据病毒抗原载量以及持续暴露于大量抗原时间，T细胞以逐步、分层的方式呈现出功能耗竭：首先，失去的是细胞毒性功能；随之失去产生TNF-α、IFN-细的能力；最后，丧失扩增能力。慢性乙型肝炎（CHB）患者应用核苷（酸）类似物（NA）治疗，正是通过对HBV的长期抑制，减少病毒抗原，也可使T细胞应答功能得到部分恢复。

　　此外，肝脏的环境特征，包括肝细胞和肝脏归巢细胞的耐受性以及慢性感染患者肝内富集的IL-10、TGF-β和精氨酸酶等，均对T细胞功能具有不良影响。耗竭的T细胞可高水平地表达共同抑制性分子，诸如TIM3、CTLA-4、2B4和PD-1等，可转换抑制信号至T细胞。同时，CD3同链表达下调引起的TCR信号损害以及bim上调引起的T细胞凋亡，也解释了持续暴露于高浓度病毒抗原和炎症下可改变T细胞功能的原因。慢性HBV感染时，作为从坏死的肝脏细胞释放以及肝脏浸润细胞群分泌的结果，肝脏的精氨酸酶活性显著增强，表明肝内的精氨酸消耗对T细胞功能异常也可能具有致病作用。研究显示，添加L精氨酸可恢复CD3ζ表达，并且提高T细胞功能。T细胞功能损害还可促使调节性CD4+FoxP3+ T细胞的超活化，抑制病毒特异性T细胞，从而影响抗病毒应答的质量和强度。

　　从免疫学角度看抗病毒治疗

　　基于以上论述，从免疫学角度来看，治疗HBV感染的首要目标应该是恢复患者的抗病毒性T细胞功能，首选策略就是应用抗病毒药物降低HBV抗原血症。

　　HBeAg阳性CHB患者应用拉米夫定治疗后，HBV特异性CD4+和CD8+T细胞应答有所改善，但这种恢复是暂时性的，治疗后6个月时，T细胞的反应性降低至治疗前水平。HBeAg阴性患者应用NA治疗后，HBV DNA得到持续抑制，HBV特异性T细胞功能可逐步持续恢复，尤其是发生HBsAg清除的患者可检测到最强效的HBV特异性T细胞应答，应答的质量和强度与急性HBV感染恢复者相似。然而，即使是在HBsAg持续转阴后，T细胞功能往往仅能部分恢复，与急性HBV感染自发恢复者相比，T细胞的抗病毒应答能力仍不健全。

　　IFN-α治疗，尽管具有免疫调节作用，并不能使HBeAg阴性的CHB患者外周血抗病毒T细胞应答有效恢复，它只是对增殖性HBV特异性T细胞应答具有晚期效应，表现为在治疗最后几周和随访期间，应答和无应答的患者之间存在显著性差异。在IFN-α治疗过程中，HBV抗原的衰减可能并不足以恢复T细胞的应答能力，并且IFN-α具有抗增殖的效应，促使HBV特异性T细胞对外源性刺激应答较弱。

　　抗病毒性T细胞功能的重建策略

　　在临床实践中，应用恩替卡韦或替诺福韦酯等强效NA治疗，可以有效抑制CHB患者的HBV DNA水平，但是，HBsAg降低非常缓慢，需要长期治疗，因此，迫切需要新的治疗策略，加速HBsAg清除，从而缩短NA疗程。NA/IFN-α序贯治疗可能是有效的策略，应用NA抑制HBV DNA，可降低HBV的抗原载量，再序贯应用IFN-α，恢复T细胞的应答能力，可以促使HBsAg清除和抗-HBs血清学转换的发生。

　　应用抗-PD-1治疗感染HCV的黑猩猩，可观察到HCV病毒载量的显著降低，与肝内CD4+和CD8+ T细胞对多种HCV蛋白的免疫应答恢复有关；应用人抗-PD-1治疗慢性HCV感染患者，包括既往对IFN治疗失败者的研究也表明，可使HCV RNA大幅降低。因此，抗-PD-1免疫治疗或许也可促使对HBV感染的控制。

　　应用重组、DNA或肽类T细胞疫苗，与抗-PD-1具有协同作用，可促使T细胞免疫应答的恢复，有效抑制病毒复制。临床前研究表明，应用TLR-7激动剂GS-9620，可以使土拨鼠和黑猩猩的HBsAg和HBV DNA水平显著降低，并且安全性良好。TLR-8激动剂可通过激活肝内的单核细胞产生IL-12和IL-18，进而激活人体肝脏内的先天性免疫细胞，产生大量IFN-活。

　　因此，将来有效治疗HBV感染的免疫调节策略可能为：首先应用NA治疗，降低HBV抗原载量，然后，应用抗-PD-1等阻滞抑制性通路，并且序贯应用IFN-α，以及应用治疗性T细胞疫苗或TLR激动剂等治疗，刺激T细胞，从而使耗竭的T细胞功能逐步得到恢复。

　　（根据2015年巴黎肝炎会演讲幻灯整理）